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猪链球菌2型不同毒力菌株的鉴别及Pan
发布机构:本站原创    浏览次数:次 发布时间:2019-10-05

  猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原,可引起人和猪的败血症、关节炎、脑膜炎、心内膜炎等多种疾病,严重威胁公共卫生安全。根据荚膜多糖抗原的不同,可将猪链球菌分为33个血清型(1/2,1-31,33),其中血清型2型(SS2)在世界范围内报道最多且致病性最强。我国曾爆发两次人感染SS2疫情,并造成严重的人员伤亡。目前,对SS2毒力因子的研究逐渐增加,但是其致病机理仍不明确。SS2不同菌株致病力存在差异,但是缺乏合适的毒力评价体系,严重阻碍对致病性SS2的鉴定。本研究将斑马鱼感染模型内标化,并成功筛选到若干SS2弱毒株。通过对SS2泛基因组(pan-genome)的分析,鉴定出强、弱毒株基因组的系列差异,为进一步研究SS2致病机理提供理论依据。1猪链球菌2型弱毒菌株的筛选综合考虑菌株分离时间和地域跨度,从本室菌种库挑选105株SS2菌株,通过PCR检测菌株中菌毛相关基因sbp2和毒力相关基因mrp,epf,sly的分布,并鉴定出sbp2-/mrp-/epf/sly-、sbp2+/mrp+/epf+/sly+等6种基因型。利用斑马鱼感染模型测定不同基因型菌株的毒力,并以已知的弱毒株T15和强毒株ZY05719作为参考菌株,即内标。通过比较待检菌株和参考菌株的半数致死量(LD5O),评估待检菌株毒力水平。结果表明,我们成功筛选到16株SS2弱毒株,基因型为sbp2-/mrp-/epf/sly-(13株)或sbp2-/mrp+epf+/sly+(3株),这也说明菌毛相关基因sbp2似乎比mrp,epf,sly更适合作为SS2毒力靶基因。2猪链球菌2型泛基因组分析选取7株SS2弱毒株完成基因组测序,并结合NCBI数据库,共获得10株强毒株和9株弱毒株全基因组信息,以此进行猪链球菌2型泛基因组(pan-genome)分析。结果显示,pan-genome由1,239个核心基因和2,436个可变基因组成,进化分析表明强、弱毒株进化差异明显,9株弱毒株又可分为Ⅰ、Ⅱ两组(两个分支)。噬菌体预测分析发现,弱毒株中含有更多前噬菌体序列。通过比较强毒株和弱毒株各自的核心基因组(core-genome),发现了强毒株共同特有的菌毛相关基因簇。通过比较强毒株和Ⅱ组弱毒株的core-genome,鉴定出强、弱毒株各自特有的53和58个基因。3 mrp基因型与猪链球菌2型菌株的毒力关系Pan-genome分析涉及的9株弱毒株的core-genome由1,459个基因组成,其中包括mrp基因,与我们筛选出的弱毒株PCR结果冲突(13株弱毒株呈mrp阴性),说明该基因序列可能存在多样性。本研究通过比对不同菌株中mrp序列,鉴定其保守区和高变区,并分别设计引物(mrp-1、mrp-2),检测不同SS2菌株的mrp基因型。分析发现,mrp基因在SS2菌株中广泛分布,但其序列存在差异。通过斑马鱼感染模型检测毒力,发现mrp-A型(mrp-1+//mrp-2+)菌株比B型(mrp-1+/mrp-2-)菌株毒力强;且实时荧光定量PCR结果表明A型菌株的mrp转录水平更高。4猪链球菌2型pnuC基因缺失株的构建及致病性分析比较10株强毒株和Ⅱ组弱毒株(7株菌)的core-genome,发现了强毒株特有的53个基因,包括位于同一操纵子上的nadR,pnu和mufT基因。我们以猪链球菌2型强毒株ZY05719为研究对象,采用融合PCR和同源重组方法,使用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET-4S成功构建了 pnuC基因缺失株△pnuC。通过斑马鱼模型,评价野生株ZY05719与缺失株△pnuC毒力水平,发现缺失株对斑马鱼的致病力相对于野生株明显降低。说明pnuC基因对SS2致病性的发挥具有重要意义。

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